农业农村部印发《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全

发布时间:2022-08-21 14:27:45 来源:火狐官网登录 作者:火狐电竞直播

  原标题:农业农村部印发《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》

  为进一步规范新饲料和新饲料添加剂安全性评价工作,根据《饲料和饲料添加剂管理条例》和《新饲料和新饲料添加剂管理办法》,我部制定了《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》,现予印发,请遵照执行。

  1.1 本指南规定了直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价的基本原则、基本要求、评价方法以及结果判定。

  1.2 本指南适用于新饲料添加剂评审和已经批准使用的饲料添加剂再评价时,对直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株开展的鉴定及其安全性评价,包括发酵制品中与生产菌株直接相关的安全性评价。

  1.3 本指南仅涵盖直接饲喂微生物和发酵制品与生产菌株相关的鉴定及其安全性评价,产品的其他安全性评价按照相关规定和指南开展。

  1.4 本指南所称微生物包括细菌、酵母和丝状真菌。其他如古菌、微藻等微生物的相关评价可参照本指南要求,采取个案分析评价。

  1.5 本指南适用于通过农业转基因生物安全评价、获得农业转基因生物安全证书的转基因微生物生产菌株及其发酵制品的相关内容评价。

  1.6 饲料或饲料原料发酵生产所用微生物菌株的鉴定及其安全性相关内容评价参照本指南进行。

  微生物在受控制条件下,通过生命活动生产的特定代谢产物经分离、提取、纯化、精制和干燥等工艺制成的饲料添加剂,如氨基酸、维生素、酶制剂等。

  合成或天然存在的能杀死微生物或抑制其在动物或人体内生长或繁殖的活性物质,在本指南中特指抗菌药物。

  注:本指南中抗菌药物包括用于人体或动物的世界卫生组织(WHO)定义的极为重要抗菌药物(CIAs)或高度重要抗菌药物(HIAs)。

  在对特定抗菌药物典型敏感的菌种中,由于获取外源基因或基因突变引起某一菌株对该抗菌药物产生的耐药。

  已知毒力因子的编码基因、耐药基因,以及与已知毒性化合物产生等有关的基因。

  根据抗菌药物对特定微生物类群(种或属)的最低抑菌浓度(MIC)分布而设定的,用于耐药判定的值。

  3.1 直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价应基于当前的科学认知开展,具体的评价试验应遵循本指南规定的一般原则,并结合直接饲喂微生物和发酵制品特征属性进行方案设计和试验实施。

  3.2 直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价试验应按照国家、行业标准或参照国际组织标准检测方法、技术规范等进行,若无相关标准检测方法、技术规范则按照行业公认的检测方法进行。

  3.3 直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价试验(包括检测)应由具备微生物相关专业知识和试验技能的专业人员在具备相应设施设备的试验场所,按照规范的操作程序进行。试验应在有效的质量控制下开展,并且由试验机构指定的负责人负责。用于新饲料添加剂申报的,微生物鉴定及其安全性评价试验应由农业农村部指定的评价试验机构开展。农业农村部尚未指定评价试验机构的,应由具有相应条件和能力的检测评价机构开展。

  3.4 直接饲喂微生物或发酵制品生产中使用复合菌株时,应分别针对每个菌株开展相关评价。

  3.5 本指南中涉及的用于菌株安全性分析、比对、评价的相关数据库、药物名单等,应采用最新版本。

  3.6 鉴于菌株在使用过程中可能产生变异或衰退,开展安全性评价时应充分考虑菌株鉴定报告及安全性评价相关检测报告的时效性。

  通过形态观察、生理生化检测和分子生物学分析等技术方法对直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株进行鉴定。通过表型试验、分子生物学试验、全基因组序列(WGS)分析、相关文献资料综述等,对微生物产毒能力和致病性、抗菌药物敏感性、抗菌药物产生等特性进行评价,对直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株安全性进行综合评估。不同微生物及生产菌株评价基本要求见表1。

  明确直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株的来源、属名、种名(包括中文学名、拉丁学名等)和菌株名称或编号。细菌的命名应遵循原核生物系统学国际委员会(ICSP)的规定,并符合原核生物国际命名法规(ICNP)要求。酵母和丝状真菌的命名应符合国际藻类、真菌和植物命名法规(ICN)的要求。明确菌株的改良史,包括实施的诱变步骤和遗传修饰。转基因生产菌株的遗传修饰按照5.6的要求进行描述。

  直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株应明确鉴定至少到种或亚种水平。若根据最新方法和当前知识菌株无法明确鉴定至已有物种,应进行菌株及其近缘种的系统发育分析。

  ——形态观察:包括菌落颜色、形状、边缘、透明度等宏观形态观察,以及菌体大小、形状、革兰氏染色反应、是否有芽胞、芽胞的着生位置等微观形态观察。

  ——生理生化检测:包括碳源利用、氮源利用、氧化酶反应、过氧化氢酶反应等关键生理生化特征检测。

  ——分子生物学分析:如16S rDNA序列、持家基因序列或WGS等分析。用于新饲料添加剂申报的,应利用WGS数据进行分析鉴定。

  ——形态观察:包括菌落质地、颜色、边缘等宏观形态观察,以及菌体大小、形状、是否有真假菌丝、生殖方式等微观形态观察。

  ——生理生化检测:包括碳源利用、糖类发酵、氮源利用等关键生理生化特征检测。

  ——分子生物学分析:如26S rDNA、ITS rDNA等特征序列或WGS分析。

  ——形态观察:包括菌落的质地、颜色、生长速度、色素的产生等宏观形态观察,以及菌丝的颜色、产孢结构的大小及发生方式、孢子颜色、形状、是否具有有性生殖结构等微观形态观察。

  ——分子生物学分析:如18S rDNA序列、ITS rDNA序列及其他特征基因(如微管蛋白基因、钙调蛋白基因、翻译延伸因子等)序列或WGS分析。

  采用二代和三代测序技术对直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株进行全基因组测序,获得其基因组完成图,测序报告至少应包括以下信息:

  DNA提取方法;测序方案和仪器;序列组装方法,如生物信息学方法、从头测序或重测序等;序列质量评价,如平均Phred得分、reads数目、覆盖度、N50和K-mer等;WGS的FASTA电子文件;相对于预期基因组大小的contigs总长度;基因注释方法;对于酵母和丝状真菌,还需提供从相关数据库(如BUSCO数据库)获得的注释质量信息。

  应通过国内外安全性评价资料综述、动物致病性试验和WGS分析对直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株的产毒能力和致病性进行综合评价,其中丝状真菌还应开展产毒试验。

  鉴于屎肠球菌(Enterococcus faecium)和芽胞杆菌(Bacillus spp.)已有成熟的致病性评价方法,可分别按附录A和附录B开展评价。

  通过国内外文献数据检索(具体要求见附录C),收集整理菌株的国内外使用历史、安全性评价资料,包括对人和靶动物的产毒能力和致病性的相关信息;若无该评价菌株的上述资料,应收集整理同种内其他菌株或与其相近种属的相关信息。若对菌株进行了任何降低毒性和致病性的选育(包括诱变和/或遗传修饰),应予以说明。

  制备直接饲喂微生物或发酵制品生产菌株的菌悬液,将其作为受试物,通过腹腔注射和经口灌胃等途径给予实验动物,评价不同暴露途径下受试物对实验动物的致病性。动物致病性试验按照国家、行业标准方法开展。

  将菌株WGS与最新数据库(包括但不限于VFDB、PAI DB、CGE等)中存储的序列进行比对,分析菌株遗传物质中是否存在已知毒力因子的编码基因。分析结果重点关注该种或近缘种中已知毒力因子(如毒素、入侵与粘附因子)的完整编码基因。结果至少应包括如下信息:基因名称、定位(染色体或质粒)、编码蛋白的功能、覆盖度(序列长度覆盖度≥70%)、相似性百分比(输入序列与数据库中序列的匹配度≥80%)和e值(<10-5)等。

  若菌株有WGS数据,则通过定向搜索确定菌株是否存在与产毒相关的已知代谢途径。

  对于丝状真菌,应在多种基质和条件下(单品种固体、多品种固体复合、不同成分液体组合等)进行产毒试验,并按照国家标准检测方法或国际组织规定的标准检测方法进行已知毒性化合物含量检测。

  对于发酵制品生产菌株,若产毒试验检测到已知毒性化合物,还应通过检测分析证明发酵制品中不含该化合物或该含量下风险无需关注。

  5.3.5.1 动物致病性试验显示受试物组动物在试验期间出现中毒症状或死亡,或试验期间体重等指标与对照组相比有显著性差异时,则判定菌株具有致病性。

  5.3.5.2 产毒试验检测到已知毒性化合物时,则判定丝状真菌菌株具有产毒能力。

  5.3.5.3 动物致病性试验显示无致病性的微生物,但WGS分析存在以下情况的,需结合国内外文献资料综述、毒力因子编码基因或产毒代谢相关基因发挥作用的机制、相关基因变为活性基因的可能性等情况进行综合判断。对于发酵制品生产菌株,还应结合生产工艺、终产品中生产菌株和已知毒性化合物的存在情况等进行综合判断。

  ——WGS分析显示存在已知毒力因子的编码基因(或产毒代谢相关基因)的细菌或酵母;

  ——产毒试验未检测到已知毒性化合物,但WGS分析显示存在产毒代谢相关基因的丝状线 抗菌药物敏感性

  直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株为细菌的,应开展抗菌药物敏感性评价。通过开展测定抗菌药物MIC值的表型试验和WGS分析,评价菌株是否具有获得性耐药。

  至少对菌株进行附录D所列抗菌药物MIC值的测定。对于附录D中未列出的细菌,革兰氏阳性菌应选择附录D中“棒状杆菌和其他革兰氏阳性菌”规定的抗菌药物,革兰氏阴性菌应选择附录D中“肠杆菌科”规定的抗菌药物。

  MIC值测定应采用琼脂或肉汤二倍梯度稀释法进行定量测定,采用国际或国内标准方法,如EUCAST、CLSI、ISO、WS等标准方法。除非抗菌药物不适用定量方法进行测定,否则不得采用定性或半定量方法(如扩散法)间接测定MIC值。

  MIC测定通常应选择药物敏感性试验专用培养基,如Muelle-Hinton或IsoSensitest培养基。对于某些特定菌种或菌株,可以根据微生物特性选择其他针对性培养基,如某些乳酸菌和双歧杆菌的乳酸菌药物敏感性试验培养基(LSM)。试验过程中应同时关注培养基组分(如对氨基苯甲酸、胸苷、甘氨酸、二价阳离子等)、试验类型(肉汤微量稀释或琼脂稀释)和培养条件(如pH、温度、培养时间)等因素对某些抗菌药物敏感水平的潜在影响。

  通过将测定的MIC值与附录D中给出的各抗菌药物的临界值进行比较,以区分耐药菌株和敏感菌株。

  对于附录D中未列出的细菌,测定的MIC值应与该种或相关种的已发表文献值进行比较。

  对菌株WGS进行分析,检测对用于人或动物的抗菌药物(WHO发布的CIAs或HIAs)耐药的编码基因或起促进作用的基因。对菌株WGS进行分析时,应将其与最新耐药基因分析数据库进行比对,如CARD和ResFinder等。分析结果重点关注抗菌药物耐药性完整编码基因,至少应包括如下信息:基因名称、定位(染色体或质粒)、编码蛋白的功能、覆盖度(序列长度覆盖度≥70%)、相似性百分比(输入序列与数据库中序列的匹配度≥80%)和e值(<10-5)等。

  5.4.3.1 当测定的MIC值≤临界值(附录D),若通过WGS分析未发现选定抗菌药物的耐药基因,则认为菌株不具有获得性耐药;若通过WGS分析检测到选定抗菌药物的耐药基因时,应评估耐药基因变为活性基因的可能性(如与活性基因序列进行比较等),并进行综合判断菌株是否具有获得性耐药。

  5.4.3.2 当测定的MIC值>临界值(附录D),若通过WGS分析未发现与选定抗菌药物表型相关的已知耐药基因,则认为菌株不具有获得性耐药;若通过WGS分析检测到与抗菌药物表型直接相关的已知耐药基因,则认为菌株具有获得性耐药。

  5.4.3.3 对所有菌株,若通过WGS分析,发现存在除附录D中选定抗菌药物以外的其他CIAs或HIAs的耐药基因,则应分别测定对应抗菌药物的MIC值,并与文献值进行比较:

  ——当MIC值≤文献值,应评估耐药基因变为活性基因的可能性(如与活性基因序列进行比较等),并进行综合判断菌株是否具有获得性耐药;

  应对直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株是否产生人或动物用抗菌药物(WHO发布的CIAs或HIAs)进行评价,已知不产生人或动物用抗菌药物的微生物菌种除外。产品生产过程中若使用任何抗菌药物,应予以说明。

  应评价培养物上清液对抗菌药物敏感的参考菌株的抑菌活性。推荐EUCAST、CLSI等相关方法中的参考菌株,也可使用国家级菌种保藏中心的等效菌株,也可根据实际生产情况增加参考菌株。若检测结果显示拟评价菌株培养物上清液对一种或一种以上参考菌株出现抑菌活性,应对抑菌物质进行鉴定,确定其是否为人或动物用抗菌药物。

  若用于发酵制品的生产菌株能产生人或动物用抗菌药物,应证明发酵制品中无抗菌药物残留。应明确说明用于抗菌药物残留检测样品的具体采样阶段。样品应来自工业化生产线,若尚无工业化产品,可采用中试产品。

  转基因微生物的插入序列可来自于特定生物体,也可以通过设计获得。当插入的DNA是由不同来源的序列组合而成时,应分别提供每条序列的相关信息。

  提供供体生物属和种水平的分类学信息。若序列来自环境样品,应提供与其最近的直系同源基因。对插入序列的描述应包括以下内容:

  ——编码蛋白质的名称,推导的氨基酸序列和功能,提供编码酶的EC编号(如有)。

  设计序列是非自然存在的基因序列,如密码子优化基因、合理设计嵌合/合成基因或包含嵌合序列的基因等。描述应包括以下内容:

  ——应通过与最新数据库(如ENA、NCBI、UniProt等)比对,确定重组蛋白的功能结构域,并描述数据库中与插入序列相似性最高的蛋白信息。

  用于新饲料添加剂申报的,应利用WGS分析菌株遗传修饰的结构特征。应提供包括遗传修饰的所有基因组区域(染色体、重叠群或质粒)图谱或图示的详细说明,包括:

  ——插入、修饰或缺失的开放阅读框(ORF)。应详细描述每个ORF的基因产物信息,至少包括氨基酸序列、功能和代谢作用。重点描述引入的关注基因,包括毒力/产毒、产临床相关抗菌药物、耐药性等相关基因。

  ——插入、缺失、修饰的非编码序列。对序列(如启动子、终止子等)的作用和功能进行描述。

  可通过比较转基因微生物与未经修饰的受体菌株的WGS完成上述分析。应对用于分析和比较的序列/数据库及方法进行详细说明。

  对于无法获得WGS的酵母或丝状真菌,应对遗传修饰的所有步骤进行描述。所提供的信息应能识别所有可能引入受体微生物中的遗传物质。主要包括载体特征、遗传修饰过程、残留的载体或供体DNA结构及关注基因。

  描述载体的来源和类型(质粒、噬菌体、病毒、转座子),若使用了辅助质粒,也应予以描述;提供所有功能元件和其他载体元件位置图谱,并对该图谱进行详细阐述,用以标识每个元件,包括编码和非编码序列、复制和转移的位点、调控元件、耐药基因及其大小、来源和作用等信息。

  应对遗传修饰过程进行详细描述,包括DNA插入、缺失、替换或改造至受体的方法,以及筛选转基因微生物的方法;说明引入的DNA在微生物中的存在位置,明确插入基因是否在载体上,或是插入到染色体和/或真核微生物的细胞器(如线)转基因微生物中残留的载体和/或供体核酸结构

  详细说明实际插入、替换或修饰序列的位置图谱;对于序列缺失的情况,必须提供缺失区域的大小和功能。

  若在遗传修饰过程中可能引入关注基因(包括遗传修饰过程中使用的载体、辅助质粒以及用于转化的质粒/复制子序列中的关注基因),应通过检测证明转基因微生物中不存在该关注基因。

  ——Southern杂交应设置适宜的阳性和阴性对照。应说明所使用探针的长度、位置,琼脂糖凝胶中DNA的上样量及印迹前的凝胶图像。阳性对照的浓度应为生产菌株每个基因组中靶片段的1~10个拷贝。若使用多个探针,则应采用独立的试验分别进行测定。

  ——PCR扩增应设置阳性对照和阴性对照。阳性对照应包括两种:含有遗传修饰过程中引入的关注基因的对照;用于排除PCR抑制的对照。

  发酵制品中应不含有生产菌株活细胞。应详细描述生产过程中去除或灭活微生物的处理工艺步骤,并通过检测证明发酵制品中无生产菌株活细胞。

  采用可培养方法检测产品中是否存在生产菌株活细胞。具体的样品采集、样品前处理、培养条件、质控试验和鉴定确认要求见附录E。

  对于由相同上游发酵工艺(包括发酵、提取等)生产的中间产品,经不同后处理工艺(如与载体或稀释剂混合、包被等)获得的不同配方添加剂产品,应至少对发酵中间产品进行评价。若为不同发酵生产体系生产的产品,应对每个产品分别评价。

  采用特异PCR方法对生产菌株特定DNA片段(如获得性耐药基因、遗传修饰目的基因)进行检测。特异PCR方法涉及的样品采集、DNA提取、PCR扩增和质控要求见附录F。

  ——不具有获得性耐药、不产生临床相关抗菌药物、无致病性/产毒能力的菌株判定为无危害。

  ——具有获得性耐药的菌株判定为具有危害,对靶动物和添加剂暴露物种具有风险,不建议用于直接饲喂微生物的生产。

  ——具有致病性/产毒能力,或产生人或动物用抗菌药物的菌株判定为具有危害,对敏感靶动物和添加剂暴露物种具有风险,不建议用于直接饲喂微生物的生产。

  ——具有致病性/产毒能力,或产生人或动物用抗菌药物的菌株判定为具有危害,对敏感靶动物和添加剂暴露物种具有风险,不建议用于直接饲喂微生物的生产。

  ——不具有获得性耐药、不产生临床相关抗菌药物、无致病性/产毒能力的生产菌株判定为无危害,发酵制品无生产菌株引起的风险。

  ——具有获得性耐药的生产菌株判定为具有危害。若生产菌株携带获得性耐药基因,并且在发酵制品中检测到长度足以覆盖耐药基因的完整DNA片段,则发酵制品对靶动物和暴露物种具有风险,不建议该菌株用于发酵制品的生产;若发酵制品中未检出生产菌株相关耐药基因DNA片段,则认为不具有风险。

  ——具有产毒能力,或产生临床相关抗菌药物的生产菌株判定为具有危害,发酵制品对敏感靶动物和暴露物种具有风险,不建议该菌株用于发酵制品的生产,除非证明发酵制品中不存在相关毒素或抗菌药物。

  ——不产生临床相关抗菌药物且无致病性/产毒能力的生产菌株判定为无危害,发酵制品无生产菌株引起的风险。

  ——具有产毒能力,或产生临床相关抗菌药物的生产菌株判定为具有危害,发酵制品对敏感靶动物和暴露物种具有风险,不建议该菌株用于发酵制品的生产,除非证明发酵制品中不存在相关毒素或抗菌药物。

  ——不具有获得性耐药、不产生临床相关抗菌药物、无致病性/产毒能力、遗传修饰未引入/改变关注基因,且按照5.8所述方法,在发酵制品中未检出生产菌株重组DNA的生产菌株判定为无危害,发酵制品无生产菌株引起的风险。

  ——具有获得性耐药的生产菌株判定为具有危害。若发酵制品生产菌株携带获得性耐药基因,并在发酵制品中检测到耐药基因的完整DNA片段,则发酵制品对靶动物和暴露物种具有风险,不建议该菌株用于发酵制品的生产;若发酵制品中未检出生产菌株相关耐药基因DNA片段,则认为不具有风险。

  ——若生产菌株具有产毒能力,或产生临床相关抗菌药物,则菌株判定为具有危害,发酵制品对敏感靶动物和暴露物种具有风险,不建议该菌株用于发酵制品的生产,除非证明发酵制品中不存在相关毒素或抗菌药物。

  ——无致病性/无产毒能力、不产生临床相关抗菌药物、遗传修饰未引入/改变关注基因,且按照5.8所述方法,在发酵制品中未检出生产菌株重组DNA的菌株判定为无危害,发酵制品无生产菌株引起的风险。

  ——具有产毒能力,或产生临床相关抗菌药物的生产菌株判定为具有危害,发酵制品对敏感靶动物和暴露物种具有风险,不建议该菌株用于发酵制品的生产,除非证明发酵制品中不存在相关毒素或抗菌药物。

  屎肠球菌(E. faecium)包括两个类群。其中一个类群主要为分离自健康个体粪便的菌株,其特征是对氨苄西林敏感。另一个类群主要为临床分离株,其特征是对氨苄西林耐药。屎肠球菌致病性评价中,除对氨苄西林耐药性进行评价外,致病岛标记基因esp、类糖基水解酶基因hylEfm和标记物IS16也是屎肠球菌评价的关注点。

  ——若MIC值>2 mg/L,则认为该菌株对氨苄西林耐药,判定菌株具有致病性。

  ——若MIC值≤2 mg/L,则认为该菌株对氨苄西林敏感,还应利用WGS分析是否含有遗传元件esp、hylEfm和IS16。若未检测到上述三种遗传元件,则判定该菌株不具有致病性危害。若检测到上述三种遗传元件中的一种或多种,则判定该菌株具有致病性。

  蜡样芽胞杆菌群(Bacillus cereus group)菌种普遍存在产毒能力,不建议将其用于直接饲喂微生物和发酵制品生产。如确需使用,应对菌株进行动物致病性试验和WGS分析。若动物致病性试验显示受试物组动物在试验期间出现中毒症状或死亡,或试验期间体重等指标与对照组相比有显著性差异时,则判定菌株具有致病性。若无动物致病性,但WGS分析发现菌株具有肠毒素的编码基因(如非溶血性肠毒素基因nhe、溶血素BL基因hbl和细胞毒素K基因cytK)及呕吐素合成酶基因ces或相似基因,则判定菌株具有致病性,除非能证明该基因不具有功能性。

  对于蜡样芽胞杆菌群(B. cereus group)以外的其他芽胞杆菌(Bacillus spp.),应通过开展动物致病性试验或细胞毒性试验评价菌株致病性。细胞毒性试验方法如下:

  将菌株接种于脑心浸液肉汤(BHI)培养基中,30℃培养6 h至细胞浓度达到108 CFU/mL以上,15000 r/min室温离心5 min,吸取上清液作为供试品备用。

  将Vero细胞接种至添加5%胎牛血清的最小必需培养液(MEM),于24孔板中培养2~3 d,确认Vero细胞融合后去除培养液,用1 mL预热(37℃)的MEM培养液洗涤细胞1次。按如下步骤开始检测:

  ——每孔中依次加入1 mL预热(37℃)的低亮氨酸培养液和100 μL供试品,37℃孵育2 h。

  ——去除含有供试品的低亮氨酸培养液,每孔加入1 mL预热(37℃)的低亮氨酸培养液,洗涤1次。

  ——去除放射性培养液,每孔中加入5%三氯乙酸1 mL,室温放置10 min。去除三氯乙酸,每孔加入1 mL 5%三氯乙酸,洗涤2次。

  ——去除三氯乙酸,每孔加入100mmol/L氢氧化钾300 μL,室温放置10 min。将每孔中的混合物转移至含有2 mL闪烁液的闪烁管中,涡旋混匀,使用闪烁计数器计数1 min放射性。

  ——未添加供试品的Vero细胞作为阴性对照。可使用具有已知细胞毒性的蜡样芽胞杆菌菌株的表面活性素(或培养物上清液)作为阳性对照。

  蛋白质合成抑制率=(阴性对照放射性-测试样品放射性)/阴性对照放射性×100%

  也可使用荧光分光光度计测量Vero细胞悬浮液的碘化丙啶染色法进行细胞毒性试验。该方法使用培养2d的单层融合Vero细胞。用含碘化丙啶(5 μg/mL)的2 mL EC缓冲液(含135 mmol/L氯化钠、15 mmol/L HEPES、1 mmol/L氯化镁、1 mmol/L氯化钙和10 mmol/L葡萄糖,用Tris调节至pH 7.0~7.1)将细胞调节至终浓度106个/mL的悬液,置于1cm石英比色皿中,37℃恒温保存。向上述细胞悬液中加入100μL供试品,使用磁力搅拌器和搅拌子连续混合细胞,在575/615 nm的激发/发射波长和5nm狭缝条件下,每隔30s进行荧光连续检测。若检测结果超过阳性对照(通常为使用清洗剂处理的细胞)荧光/吸光度20%以上,则认为菌株具有细胞毒性。通常情况下,结果无需去除背景荧光。

  文献检索至少应涵盖最近20年的相关信息源。相关文献列表应通过参考文献管理软件进行编辑并提交。对重要文献应提供复印件。用于新饲料添加剂申报的,申请者必须确保提交的出版物或信息满足其版权所有者规定的条款。

  每个发酵制品产品至少取3个批次,每个批次至少取3个样品进行检测。样品应从工业化生产线采集,记录采样点所处的具体生产阶段。若尚无工业化产品,可采用中试产品,但应明确中试生产工艺(发酵及后处理工艺)具有工业化生产工艺的代表性。

  每个样品至少取10 g(mL)进行前处理后制备检液。如固体样品:称取10 g,加入90 mL灭菌生理盐水,充分振荡混匀,使其分散混悬,静置后,取上清液作为1∶10稀释的检液。水溶性液体样品:用灭菌吸管吸取10mL样品,加入90 mL灭菌生理盐水,混匀后制成1∶10稀释的检液。至少取10 mL上述检液进行生产菌株活细胞培养检测。用于培养检测的检液中至少含有1 g(mL)样品。

  采用可培养的方法分析发酵制品中生产菌株活细胞存在情况。选择适宜的培养条件(包括培养基、培养温度和时间等),确保生产菌株活细胞生长。应使用最小选择压力的培养基(如常用于培养革兰氏阴性细菌和芽胞杆菌的胰蛋白胨大豆琼脂培养基、常用于培养酵母的麦芽浸粉琼脂培养基、常用于培养丝状真菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基等),延长培养时间(至少长于两倍常规培养时间)使受损细胞恢复。若菌株能形成芽胞,应采用适宜的萌发程序(如细菌热处理),使其萌发后进行后续培养。

  培养检测时,每批次样品应设置阳性对照,即在每批次其中1个样品中接种较低数量的生产菌株活细胞(如每个平板10~1000个菌落),以证明所用培养基和培养条件适合于产品中生产菌株活细胞的生长。

  样品经培养后,若平板上长出与阳性对照形态相似的菌落,应通过鉴定确认其是否为生产菌株。

  每个发酵制品产品至少取3个批次,每个批次至少取3个样品进行检测。样品应从工业化生产线采集,记录采样点所处的具体生产阶段。若尚无工业化产品,可采用中试产品,但应明确中试生产工艺(发酵及后处理工艺)具有工业化生产工艺的代表性。

  至少从1 g(mL)样品中提取DNA。若上游发酵中间产品浓度高于终产品浓度,可使用上游发酵中间产品提取DNA。对于相同上游发酵工艺生产的中间产品,经不同后处理工艺获得的不同配方添加剂产品,应对浓度最高的产品进行检测。若为不同发酵生产体系生产的产品,应对每个添加剂产品分别进行检测。

  应采用适合于生产菌株各类细胞形式(如营养细胞、芽胞)的DNA提取方法,确保能从产品中提取到可能残留的DNA。

  针对生产菌株的特定DNA片段设计特异性引物,通过PCR检测生产菌株DNA是否存在。应详细描述生产菌株的特定DNA片段、特异性引物、聚合酶以及扩增条件等信息。

  若生产菌株含有耐药基因(无论其是否为转基因微生物),所设计引物的扩增产物应覆盖耐药基因的完整DNA片段。

  若生产菌株为不含耐药基因的转基因微生物,所设计引物应针对遗传修饰目的基因,其扩增产物不超过1Kb。

  ——将直接从生产菌株提取的总DNA梯度稀释后,分别添加至样品中,提取DNA并进行PCR扩增,计算检测限;

  ——将直接从生产菌株提取的总DNA作为排除PCR抑制的阳性对照,即将直接从生产菌株提取的总DNA添加至从样品中提取的DNA中进行PCR扩增,以检查样品DNA中是否存在导致PCR失败的因素,如存在PCR抑制剂、核酸酶等;

  本期编辑:一只虾(微信号kxyyxia,新闻爆料、转载授权请加微信)更多新闻

  ★ 共谋水产种业振兴!中国水产流通与加工协会水产种业分会成立大会暨中国水产种业论坛在青岛召开

  近期有作者通过搜索引擎搜索到假冒科学养鱼投稿网站,投稿后不仅没有下文,更有的被骗取版面费等,本刊投稿网址为:不收取任何形式的版面费和审稿费,稿件一经录用,即付稿酬!敬请选择正确网站投稿!公 告科学养鱼致力于普及养殖技术与养殖信息分享,为中国水产养殖业转型、升级、渔民增收助力,